Bea, Thomas en de konijnen zijn samen uitgegroeid tot één grote familie, maar ook al doet hij nog zo zijn best, toch kan Pieter zijn ondeugende reputatie maar niet van zich afschudden. Als hij buiten de tuin op avontuur gaat, komt Pieter in de problemen en doet zijn familie er alles aan om hem te vinden.
Tommie Christiaan spreekt de stem in van Pieter Konijn. Zussen Shelley Vol, Amy Vol en Lisa Vol (OG3NE) nemen de stemmen van de drieling Flopsie, Mopsie en Wipstaart voor hun rekening. Verder met de stemmen van o.a. Do (Bea), Joey Schalker (Thomas Verhoef), Jan Versteegh (Benjamin Wollepluis), Levi van Kempen (Diederik Stadsmuis) en Roué Verveer (Jan Willem de Haan). De stemmen van de nieuwe personages worden ingesproken door André Dongelmans (Nigel Basil Jones), Edwin Jonker (Barnabas), Murth Mossel (Ronald Rat) en Peggy Vrijens (marketing medewerker) en Stefanie (Amelia).
In de originele versie met Domhnall Gleeson (Star Wars: The Last Jedi) als Mr. McGregor (meneer Verhoef), Rose Byrne (Annie, Bad Neighbours) als Bea en David Oyewolo (Selma) als Nigel Basil Jones. James Corden (The Prom, The Late Late Show, Carpool Karaoke) spreekt de stem in van Peter Rabbit. De stemmen van Flopsy, Mopsy en Cottontail worden ingesproken door Margot Robbie (Once Upon a Time… in Hollywood, I, Tonya), Elizabeth Debicki (The Guardians of the Galaxy: Vol. 2, The Night Manager) en Aimee Horne (Love is Now).
PIETER KONIJN OP DE VLUCHT is gebaseerd op de personages en verhalen van Beatrix Potter.